生物材料準(zhǔn)備
生物材料凍存前進(jìn)行的準(zhǔn)備工作可能會對凍存結(jié)果產(chǎn)生影響。對于非復(fù)制性材料，如組織，核酸和蛋白等，準(zhǔn)備過程包括確認(rèn)生物材料處于合適的溶液或凍存培養(yǎng)基中，此步驟的目的在于復(fù)蘇時達(dá)到zui大化的預(yù)期用途。然而，活細(xì)胞和微生物的穩(wěn)定性及復(fù)蘇活力受生長條件和凍存前準(zhǔn)備工作的影響。
細(xì)胞凍存前需考慮多種因素，包括細(xì)胞類型、活力、生長條件、生理狀態(tài)、數(shù)目以及細(xì)胞前處理等。當(dāng)建立一個新分離株或細(xì)胞系的初次種子儲備時，必須對培養(yǎng)物進(jìn)行檢測并消毒，確保微生物污染的zui小化。每次準(zhǔn)備工作后，以及每次準(zhǔn)備新批次的培養(yǎng)物時，均要重復(fù)這個步驟。
微生物
生長于通氣培養(yǎng)條件下的微生物細(xì)胞，特別是細(xì)菌和酵母，表現(xiàn)出比生長于非通氣條件下的細(xì)胞更強(qiáng)的耐受冷卻和凍存?zhèn)?nbsp;的能力。T.Nei 認(rèn)為，在通氣培養(yǎng)條件下，細(xì)胞通透性更好，且開放條件下培養(yǎng)細(xì)胞在冷卻過程中比非通氣條件下培養(yǎng)的細(xì)胞失水更快。另外，針對微生物細(xì)胞，在對數(shù)生長期后期及穩(wěn)定期早期獲得的細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的冰凍耐受性。從生長后期和靜態(tài)培養(yǎng)早期收集的微生物細(xì)胞比生長早期和生長晚期的細(xì)胞表現(xiàn)了更強(qiáng)的冰凍耐受性。
一般來講，初始凍存的細(xì)胞數(shù)目越多，復(fù)蘇率越高。對于大多數(shù)細(xì)菌和酵母而言，保證約 107/ml 的細(xì)胞數(shù)才能確保足夠數(shù)量的細(xì)胞復(fù)蘇。由于這些細(xì)胞可便捷地從瓊脂培養(yǎng)板或斜面上收集，如果需要更大量的細(xì)胞，也可使細(xì)胞生長于液體培養(yǎng)基中通過離心收集，在任何一種情況下，細(xì)胞通常懸浮在包含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基中。原生生物可以通過離心濃縮，但通常需要懸浮于使用的培養(yǎng)基中，之后使用等體積含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基稀釋。
針對芽孢菌凍存，需要收集芽孢并重懸于含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基中。凍存前，必須縮短操作時間且確保芽孢并未萌發(fā)。針對非芽孢菌凍存，凍存前需采用特殊程序收集菌絲體。某些具硬菌絲體的真菌，需將含有菌絲體的瓊脂塊從培養(yǎng)基中切出，并將其置于含凍存保護(hù)劑的新鮮培養(yǎng)基中。硬菌絲體無法與瓊脂培養(yǎng)基很好粘附，生長于肉湯培養(yǎng)基中時，凍存前需將菌絲體團(tuán)進(jìn)行混合。
凍存材料的活力和復(fù)蘇率由凍存前后的培養(yǎng)和生長狀態(tài)決定。活力是衡量培養(yǎng)物生長和繁殖的一項(xiàng)指標(biāo)。例如原生生物材料等某些材料，需經(jīng)過多次傳代才能保證其穩(wěn)定性。復(fù)蘇細(xì)胞數(shù)量的估算有多種方法，包括連續(xù)稀釋，平板計數(shù)或直接細(xì)胞計數(shù)。通過對比凍存前和復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量的差異，可說明細(xì)胞復(fù)蘇程度 或凍存過程是否成功。
在線咨詢